今天给各位分享蛋白质课前暖场的知识，其中也会对蛋白质的结构和功能说课进行解释，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注365暖场活动网（http://www.bkl365.cn），现在开始吧！
本文目录一览：
人教版高中生物 说课稿
生命活动的主要承担者――蛋白质 说课
一、说教材
（一）教材地位和作用
《生命活动的主要承担者――蛋白质》这一课题是在高中生物必修 1 第二章第 2 节。这部分内容不仅是第二章的重点内容，也是整本书的重点内容之一。它以本章的第 1 节细胞中的元素和化合物知识、生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质检测知识为基础。通过学习， 使学生明确蛋白质的结构多种多样，在生命活动中承担着多种多样的功能，是非常重要的生物大分子。为第 3 节学习遗传信息的携带者――核酸奠定了学法基础。
（二）说学习目标
在课程标准的具体内容标准中，与本节内容相对应的条目是 “ 概述蛋白质的结构和功能 ” 。 “ 概述 ” 属于理解水平，要达成这一目标，首先要理解蛋白质的基本组成单位 —— 氨基酸的结构特点，以及由氨基酸形成蛋白质的过程，因此，本节的知识目标确定为： “ 说明氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程 ” 、 “ 概述蛋白质的结构和功能 ” 。 考虑到认同生命的物质性对于树立唯物主义观点具有重要意义，而本节内容恰好说明了生命活动的物质基础的重要方面 —— 许多生命活动是靠蛋白质来完成的，因此， 在情感态度价值观方面，就确定了 “ 认同蛋白质是生命活动的主要承担者 ” 的目标。
（三）学习重点、难点
学习重点：
1 、氨基酸的结构特点，以及氨基酸形成蛋白质的过程
2 、蛋白质的结构和功能
学习难点：
由于学生缺乏有关氨基酸和蛋白质的化学知识，细胞的分子组成又是微观的内容，比较抽象，所以在学习时，以下两个知识点确定为学习难点
1 、氨基酸形成蛋白质的过程
2 、蛋白质的结构多样性的原因
二、 说教法
1 ．支架式教学法：
（ 1 ）拾脚手架：使学生明白氨基酸和蛋白质两个概念。
（ 2 ）进入情境：提出氨基酸是如何形成蛋白质的和 20 种氨基酸能够形成多少种蛋白质两个问题。
（ 3 ）独立探索：在教师的帮助下，对课本上的“氨基酸形成蛋白质的示意图”进行探索，并将氨基酸、二肽、三肽、多肽、蛋白质等几个概念排列顺序。同时对两个氨基酸形成二肽的方法提出设想。
（ 4 ）协作学习：对两个氨基酸形成二肽的设想及蛋白质的形成过程进行小组协商、讨论。最后达成一致――通过脱水缩合形成，并充分地理解了蛋白质的形成方式。
（ 5 ）效果评价：通过学生个人和小组对个人的评价。教师也可以用课内练习和课外对核酸知识的自学能力进行评价。
2 、探究教学法：本课除了利用支架式教学法之外，还在学习氨基酸和蛋白质概念时利用了探究教学法：（ 1 ）联系生活，创设情景，提出探索问题，（ 2 ）引导学生进行探究、推理，（ 3 ）查阅课本，小组讨论进行验证，（ 4 ）师生共同归纳总结探索结果。
3 、直观教学法：通过实验、图片及多媒体辅助教学软件，化静为动，化抽象为具体，增强了教学内容的直观性、启发性，使学生更好地从感性认识上升为理性认识。
三、说学法
教学是教师与学生交流的过程，选择良好的学法关键在于找到教法与学法的结合点，实现教、学的统一。根据上面的教学方法，本课采用了探究学习法与接受式学习相结合。
探究学习与接受学习并不是两种绝对对立的学习，二者只是相对而言的。从按受学习到自由或完全独立的探究学习，其间还存在着接受中有探究、探究中有接受的混合学习。而且从教育实际看，学生探究能力的形成与发展是渐进式的，而不是突发式的。因此，本课在学习方法上，结合学生刚接触生物学科不久的事实，部分实行了接受式的学习。如氨基酸是蛋白质的基本单位等知识方面采取了接受式学习，另外在探究式学习过程中，教师也给充分的帮助和指导。
利用问题探讨创设问题情境
四、教学 设计
五、说教学过程
学习阶段
教师组织和引导
学生活动
教学意图
回忆、联系，明确学习目标
生命活动的主要承担者——蛋白质这一节，分两个课时，第一课时讲什么？
蛋白质这一章节在高中生物里面还是比较重要的
第一课时：
氨基酸的分类（必需氨基酸和非必需氨基酸）
氨基酸的结构通式
蛋白质的分子结构（脱水缩合）与多样性
第二课时
4. 相关肽链数、氨基数、羧基数、肽键数、脱水数等等的计算
5. 蛋白质的功能（结构、催化、运输、调节、免疫）
2. 蛋白质组学样品前处理（2）
说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成蛋白质课前暖场，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。
第一步：剪碎去血
将样品放入PBS缓冲溶液中剪碎，倒掉变色的溶液，换入新的PBS，继续剪，一遍一遍地重复，直到PBS溶液不变色为止。比如肝脏组织，洗完后整个是一个偏黄色的组织。在这个过程中，蛋白质课前暖场我们需要用剪刀和镊子剥离血管组织和脂肪组织等，这些组织的存在会对我们对样品，比如肝脏组织的蛋白质类型产生干扰。去血的过程中同时需要加入蛋白酶抑制剂。
第二步：称重
为了称量更精确，洗涤之后可以用滤纸将样品吸干，然后再称重，能比较准确地知道我们大约使用了多少组织样品。
第三步：碎裂
碎裂样品的方法在上一篇推文里有详细的介绍，包括液氮研磨、匀浆等机械破碎，温差法、压力法等物理破碎，以及加入变性剂等化学处理法。通常情况下呢，用液氮研磨就够了，研磨到完全变成粉状。但如果用单一的方法破碎效果不好，或者操作起来工作量太大，也可以进行多方法的组合。比如十几个或几十个样品，完全靠手工的液氮研磨，跟去健身房玩一圈的运动量估计也差不多了，累成狗蛋白质课前暖场！这时候可以考虑使用组织破碎仪，一次可以做八个十个的，一起震碎，那就轻松多了。
第四步：裂解
破碎以后，加入裂解液，反复震荡，让样品充分溶解，裂解液的用量通常是
组织重量：裂解液的体积=1：5
也就是说，1克组织，通常加入5ml的裂解液。
在裂解时，眼睛不要只顾着看手机或者盯着天花板发呆，要好好观察样品的情况，如果发现仍然有大块的组织，或者很多絮状的组织，则说明上一步碎裂的工作做得还不够。这时可以加入超声的方法，或者用组织匀浆器进一步碎裂，从而保证蛋白提取比较成功。
有哪些裂解液可选呢？
第五步：离心
裂解并震荡以后，4℃ 12000rpm离心半小时，然后吸取上清液。
说到这里，插一句，以往的经验，常规小鼠和人的组织样品，提取效率大约为0.7%，也就是说，如果有100mg的组织，能提到的蛋白大概是700 μg 。做常规的质谱分析，有100-200mg的蛋白就够了。如果样品充足，我们可以分成几份，先提取一部分做实验试试，整个流程走下来没问题的话，再提一部分，这样也比较保险，不会出现全军覆没的惨剧。余下的样本，还可以做做Western验证或者酶活啥的。
如果样品量特别少，例如小鼠卵巢，一共也就黄豆那么大，这种情况下可不能用液氮研磨，因为大部分样品都会被刮到研钵的壁上，损失很大！可选的方案是：将小鼠卵巢放进试管里，直接在管子里剪碎去血，加入裂解液，用组织破碎仪或者超声破碎，也可以用4%SDS提取（ 95℃，5分钟）。这种情况就不要弄太多的碎裂步骤了，步骤越少，样品的损失就越少。
针对动物细胞样品的处理方法有很多，我们来看看几种常见的套路：
A． 最简单的方法：
把细胞从培养皿里取出来，先加入PBS把培养基洗掉，再加入裂解液，通常25mm的培养皿加入400-700μL裂解液。然后用细胞刮直接刮取培养皿表面，不停地刮，相当于是一个机械力的破裂，而细胞表面是最容易进行破裂的。刮完后收集裂解液和细胞样品到EP管里，然后进行冰上裂解。这是最快最直接有效的方法。
B．多组细胞平行实验处理方法：
当需要处理多组细胞，而每组细胞培养的时间有间隔时，如果希望后续的分析是平行的，那么可以先分别胰酶消化以后，收集每组细胞，液氮或者-80℃保存。等各组细胞都收集好后，加入裂解液，不超过200W超声，放在冰上操作。由于不能用SDS（超声时会引起大量的泡泡），这种情况下，常用的是8M尿素或2M硫脲。超声一定要在冰上进行，因为温度特别高，很容易超过37℃，循环周期的时间通常会设定为：5秒超声，停4-5秒，再5秒超声，反复，整个过程持续5分钟左右。
C．反复冻融法：
这种方法用得比较少，因为残留的细胞残片还是比较多，我们认为提取是不充分的。
D．化学处理法：
也是非常简单粗暴的方法，直接加入4%SDS，95℃水浴，1-5分钟即可。
通常情况下，我们要求细胞量需要达到1E6的数量级。当然，有一些新发展出来的方法，需要的细胞量会非常少，比较南方医科大学田瑞军老师课题组做过1000个细胞的蛋白提取，但这些新方法对操作的要求也很高，如果蛋白质课前暖场你还是个新手，没有足够的经验，直接拿新方法来做，风险就会比较高了。
对于这类样品的处理，去石蜡是比较麻烦的事情。在石蜡包埋过程中，样品中的蛋白质或脂肪会用福尔马林或甲醇固定，形成交联状的结构，从中提取蛋白是非常困难的。难归难，遇到了还是要迎难而上，咱们得想一些合适的办法把蛋白有效地提取出来。通过很多次的摸索和实践，以下是比较可行的处理步骤：
第一步： 去石蜡，先用二甲苯室温浸泡5分钟，两次，再换甲醇室温浸泡5分钟，两次。看起来很简单，但整个过程中会经过混旋。
第二步： 蛋白裂解，因为蛋白被福尔马林或甲醇固定得非常紧了，有的人会选择加入水，让样品泡涨，我们更推荐加入裂解液（0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 0.1M DTT），充分水化被固定的蛋白样品，然后匀浆和超声。
第三步： 水化之后，加入4%SDS。对于4%SDS，通常的处理条件是95℃，5分钟，但对于石蜡样品，交联特别厉害，所以推荐95℃下处理60分钟，再冷却到室温。
第四步： 离心，参数为最大相对离心力16,000 g，离心10分钟，取上清，就达到分离的目的了。
石蜡包埋样品提取的效率通常是，一平方毫米样品可提取一微克蛋白，大家可以通过这个效率值对样品中能提取的蛋白进行估算。
对于植物组织样品，难点就在于细胞壁及叶绿素的去除。
第一步： 充分再充分地研磨。由于细胞壁十分强壮，所以一定要好好地研磨，充分碎裂。一般的匀浆根本搞不定细胞壁，没办法碎得充分。
第二步： 去色素。可以通过有机溶剂多次反复沉淀样品来去除色素，比如丙酮、TCA（三氯乙酸）、甲醇，一次一次地清洗前面研磨成粉的样品，这样可以把叶绿素去掉。
第三步， 离心取沉淀，然后加入裂解液，让蛋白充分地溶解。
第四步： 进行蛋白质的抽提。在抽提的过程中，要看细胞的破碎程度或者样品的类型，叶片样品相对来说比较简单，茎的样品比较麻烦，它的纤维组织比较大，再加上植物细胞壁又比较厚，所以我们得用超声、震荡，以及各种方法组合，进行蛋白质的抽提。
第五步： 离心取上清，就得到了蛋白溶液。
根据以往经验，像叶片这类的样品，处理起来比较简单，例如水稻的叶片组织提取出来可以做到8000多个蛋白蛋白质课前暖场；根的样品稍微麻烦一点，因为含水量特别多，先得烘干，尽量去掉它的水份，干燥后再进行研磨提取。否则，我们可能会加入很多根，但其实能提取的样品并没有多少。花的组织，比如桃花、梨花，也是水分太多的问题，需要先干燥。种子组织，例如花生，在破碎成粉后，也需要多次使用有机溶剂去掉它的脂肪。
总之，根、茎、叶、果实等，根据不同的样品类型，我们需要根据它的特点设计不用的处理步骤，简单来说，就是通过有机试剂去掉它的色素和脂肪组织，水分太多的先烘干再提取，常规情况就是研磨和去色素。大家清楚了各种处理的用处之后，就可以针对自己的样品灵活地处理了。比如棉花样品，因为它纤维特别多，你可能就会想到得通过研磨和反复沉淀来进行纯化，再进行后续分析。
与植物样品类似，细菌样品的细胞壁也是我们提取蛋白的最大障碍，尤其是像革兰氏阳性菌，以及一些细菌的亚型，细胞壁特别厚，破碎的时候需要更强的参数，更长的时间。
刘晓慧老师分享了两个她遇到的例子：有一次做细菌样品，不巧它就是一个细胞壁特别厚的亚类，最开始采用急热骤冷，即从-80℃冰箱取出，95℃煮1分钟，反复几次，然后超声，但是提出来的蛋白量特别少。最后还是用了液氮研磨的方法，研磨之后再加入裂解液，才提取出大量的蛋白。所以，对于细菌的样品，我们可以尝试多种方法，测试一下。
还有一次做酵母样品，在做超声的时候，因为有点事情离开了，所以超声的时间就特别长，并且几次超声之间做了急热骤冷处理。另一位同事使用同样的方法，只是超声时间比较短。最后发现超声时间长的样品，破碎地非常好，显微镜下看到的都是酵母的碎片，提取到的蛋白也很多，而超声时间短的提取到的蛋白就少很多。所以我们在碎裂样品时，也可以多尝试几种方法，几种参数。
体液样品难点在于高丰度蛋白的去除。以血清为例，前14种高丰度蛋白占血清总蛋白的95%以上。而质谱是一种离子饱和性检测器，低丰度离子的信号很容易被高丰度的抑制，从而无法检测到。
我们有很多办法去掉高丰度蛋白。当然，有些情况下，为了保证样品的完整性，也有人不去除高丰度蛋白，这个视具体情况而定。另外，高丰度蛋白可能还会与一些低丰度蛋白相结合，当我们去掉高丰度蛋白时，往往就会将这些有意义的低丰度蛋白也去掉，无法保证分析的完整性。针对这种情况，用普通的shotgun方法是很难解决的，后面我们会介绍一种方法，它在高丰度蛋白存在的情况下，仍然可以稳定地可重复地鉴定到很多中低丰度的蛋白。
要去除高丰度蛋白，很多商业试剂盒都可以帮到我们。它们的原理各有不同，我们来看几个比较常用的。
第一种是Bio-Rad的Proteominer试剂盒。
这类试剂盒的原理是：通过一个六肽配基与高丰度蛋白结合，从而进行去除。这种方法是非抗体型的，没啥特异性，它不受物种限制和样品类型限制。当样品进来时，六肽配基会优先结合丰度高的蛋白质，丰度低的嘛，结合的机会小很多，于是就达到了分离去除的目的。
通过这个办法处理后，最终能鉴定到的蛋白也是比较多的，从鉴定的数量上看，与安捷伦的特异性试剂盒差不多。但如果要发高分的文章，用这种方法容易受到质疑，也是因为它的特异性不强，去高丰度有一定的随机性，高分杂志不太接受这种随机的方法。但如果你的样品体积特别大，可以先试着用Proteominer做一次，接下来再使用一些特异性的去高丰度蛋白的方法。或者你的样品没有特异性抗体柱可以用的话，也可以考虑这种方法。
第二种是安捷伦的MARS柱。它含有14种蛋白抗体，针对血清中的高丰度蛋白能很有针对性地去除，需要的样品量通常为20μL-40μL，20μL的血清样品可以得到约100微克的蛋白样品，40μL的量足够我们做一次iTRAQ或label free实验了。
第三种试剂盒是Thermo的Pierce Albumin/IgG的试剂盒，可以去两个高丰度蛋白。现在出了一个去20个高丰度蛋白的试剂盒，这是基于抗体方法，针对性很强，是比较公认的方法。
第四种是SIGMA公司的Human IgY14 and SuperMix Columns，2015年MCP上发表了一篇文献，里面用到这个试剂盒，先是用特异性柱子去掉14个高丰度蛋白，然后再特异性去掉50个中丰度的蛋白，最后可以鉴定到5300多个血清蛋白质。对比现在常规的方法，通常只能鉴定到500-600个血清蛋白，如果高丰度蛋白去除得比较好，用QE的方法做，也只能鉴定到1000个左右蛋白。这篇文章鉴定出了5300个蛋白质，在血清样品的蛋白鉴定中确实是一个相当outstanding的结果了。
以上是四种比较常用的去高丰度的试用盒。总的来说，针对像尿液这类体积很大的样品，可以用Proteominer的方法，因为其余的基于抗体的方法都对蛋白含量有所要求。去掉高丰度蛋白后，我们可以对尿液先进行浓缩，使它的浓度达到50μg/μL或更高，再进行后续的蛋白提取，效果会更好。另外，尿液样品也可以通过沉淀的方法对蛋白进行提取。
另外，像脑脊液样品，也可以通过Proteominer方法进行提取，它的蛋白含量也比较低。刘晓慧老师组尝试过用安捷伦的特异性去除14个高丰度蛋白的试剂盒与Proteominer的随机去除6个高丰度蛋白试剂盒进行比较，最后能检测到的蛋白结果都差不多。
针对亚细胞器的提取，我们分几步来完成：
第一步： 对组织或细胞进行匀浆，不需要匀得非常碎，通常匀个10-20下就可以了；
第二步： 初步分离，使用差速离心的方法，具体说明见上图。
第三步： 用蔗糖密度梯度离心进行再分离。蔗糖密度梯度是连续的，那么相应的亚细胞器会在等密度的蔗糖密度区间内沉积。于是，可以将溶酶体、线粒体，以及其它微体分开。然后取出对应的细胞器，再进行裂解和提取。
第四步： 对亚细胞器进行验证。这一步需要引入Western，比如用到一些线粒体特异的抗体，或者细胞膜、细胞核特异的抗体，进行样品纯度的确证，之后再进行后续的实验。否则，如果样品中有污染，会给后续的实验带来很难解释的问题。
以上是针对不同样品的蛋白提取方法，下一篇将继续分享样品前处理的余下几步，即蛋白提取的质量控制、脱盐、还原烷基化和酶解。
2. 蛋白质组学样品前处理（4）
说明：此篇笔记系2016-2017年由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂整理而成，侵删。该课程由复旦大学生物医学研究院（IBS）的刘晓慧博士所授。
自从进入了精准医学时代，蛋白质组学的发展也朝着精准医学临床应用的方向在不断发展。
我们知道，在临床应用领域，常常需要用更多的样品量来进行研究分析，得到更多的结果。比如，用几十上百例的蛋白质组学样品来进行肿瘤分析。2014年Nature上发表过一篇文章，做了95例大肠癌的分析，通过label free结果对95例进行分型。与之前的ATGC方法把大肠癌分成四个型比起来，蛋白质组学的方法可以更精准地分成五个型。这也是蛋白质组学在精准医学领域一个很好的应用实例。
（Bing Zhang, Jing Wang, et al, Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer，nature,2014,3,382）
接下来我们分享两种新方法，都可以实现简单、可重复且自动化的样品前处理效果。
第一种方法最早发表于2007年，到今年已经成立了一家公司，将这种方法发展出来的装置很好地商业化了。
当时，整套装置还需要手工来组装。不过组装的方法也非常简单，根据上面的图，分五步走:
第一步:准备好一张3M的C18过滤膜，一个枪头，一个平口的针头和一个长手柄；
第二步+第三步：在3M膜上取出一个小孔的膜，
第四步：将膜捅到EP管里面，用气把它压紧了，形成一个小的膜系统。
第五步：取出手柄和针头，带膜的枪头就完成了。
C18过滤膜有脱盐的效果，可以把蛋白质或肽段截留在上面，通过水或BUFFER体系把盐洗掉，之后再通过有机相把肽段或蛋白从C18膜上洗脱下来。
除了C18膜，还有很多种类型的膜，比如强阳离子膜、阴离子膜等。大伙儿看看下面这个图，感受一下这些膜的名字和成分。
这里的柱状图是对比不同的膜处理后能鉴定到的肽段的数量，左图是肽段水平的鉴定，右图是蛋白水平的鉴定，差别都不太大（图里的fr1，2，3是指馏分）。通过这个膜系统，可以进行分级分离，也可以进行脱盐。
时间走到2009年，又出现了一种新的FASP（ filter-aided sample preparation）方法。之前的Stagetips只是为了进行分级和富集，而FASP可进行酶解（文献见下图）。
到了2014年，这个团队又将StageTips和FASP方法结合起来，实现了所有的实验都在这个小管子里完成，样品加入后先清洗，然后还原，清洗，烷基化，再清洗，最后酶解。酶解后的肽段一直留在下图的“Reaction chamber”里，然后将肽段通过下方的膜脱盐，洗脱，或者直接通过它进行馏分的分离，收集样品。
四次重复实验检测发现，用这种装置做下来，四次都能被重复的蛋白有92.9%，只有1.6%的蛋白是其中任意一次单独鉴定到的，1.5%是其中两次鉴定到的，4.0%是其中三次鉴定到的。如果我们考虑到这个实验一共鉴定到了9,667个蛋白（human proteins），在保证了较高的鉴定率的前提下，92.9%的四次重复率已经相当不错了！并且信号强度也比较一致。由于管子体积的限制，这套装置很适合少量样品的分析。
该方法已经商业化。2016年Cell Systems上发表了一篇用这套商业化的装置做的血液样品案例。如下图，把血液样品取出来后，直接加到装备了膜系统的EP管里。通过优化整个酶解系统，整个前处理过程2个小时之内就能完成，其中裂解与还原烷基化是同时完成的。完成之后通过一个自动化仪器，进入质谱，经过0.5小时的质谱实验，以及15分钟的结果分析，最后鉴定到了300多个常规的中高丰度蛋白（这个例子中没有对血液中的高丰度蛋白进行去除）。
同样的，文章里也对这次实验进行了重复性评估，见下图。
从图上看，鉴定的重复性特别好，尤其是49种FDA批准的Biomarkers中，有41种的CV值都小于20%，说明这些biomarkers可以通过该方法可重复地检测到。这个方法被认为很有希望发展为高通量样品处理的方案。
以上是该公司的网址，有兴趣的小伙伴可以登上去看看。目前最新的进展是，重复性可以到0.99，样品处理时间缩短到了1个小时，再加上20分钟的质谱分析，总体实验时间得到了很好地控制，实现了简单快速高效且可重复的要求！我们期待这个方法能早时用到临床样品的检测上。
第二种新方法叫PCT压力循环系统。
刚才讲到，可以通过压力差来进行样品的破碎和蛋白的提取。另外，我们知道，在高压条件下，很多反应是会提高效率的，比如说酶解、还原烷基化、样品裂解等。下面这篇文章通过分析穿刺的样品（量非常少，大概只有1立方毫米），放到PCT装置里，通过样品的处理，还原烷基化，酶解，酶解之后脱盐，取出，直接进行SWATH分析。
我们来看下这种方法的结果评估。图示上方的a 图表明结果的SD（样品标准差）都很小，说明检测结果很精确；b图表明漏切的位点也很少.
图示下方的a图表明，可重复性CV值基本上都小于20%，只有其中两次的重复性实验中差异大了一点。
文章里用这个方法分析了9对胃癌的癌症与癌旁组织，然后找到了一组蛋白成为癌症的潜在标志物。
以上是两种在蛋白质临床检测方面非常有前途的方法，都实现了快速、高通量、高重现性，自动化的处理，感兴趣的童鞋可以重点关注一下。
最后，我们对整个第二讲的内容进行一个小结，如下图：
关于蛋白质课前暖场和蛋白质的结构和功能说课的介绍到此就结束了，不知道你从中找到你需要的信息了吗 ？如果你还想了解更多这方面的信息，记得收藏关注本站。
